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自动图像分析技术提供标准化和定量测量
      
  在一个典型的AQUA实验测量靶基因表达于上皮性癌,4'-6-二脒基-2 - 苯基用于核掩模(UV通道),抗细胞角蛋白抗体识别和区分上皮细胞基质(肿瘤掩模,用于),并建立了细胞质面具(CY2和/或Cy3的通道),以及针对目标的抗体用于可视化的靶基因的蛋白表达兴趣(Cy5和/或CY7通道)。然而,AQUA实验并不限于这些参数。根据不同的组织/车厢希望的掩模,实验中采用了一些不同的掩蔽标记。例如,在GBM的研究的情况下,神经元细胞,胶质纤维酸性蛋白可以用于定义一个遮蔽区域。
  一旦组织已适当染色,图像采集可以继续使用PM2000系统HistoRx公司。PM2000平台是一个自动落射荧光显微镜与随附AQUAsition的图像采集软件系统,是专为高分辨率自动化组织芯片和整个组织切片的图像采集。
  ,AQUA得分的基础是基于像素的区域设置分配条块的表达(位置)的图像分析算法。4组织是一种复杂的混合物中的各种组织成分(即,上皮细胞,间质,血管)和亚细胞成分(即,细胞质,细胞核,膜)。地方使差分图像像素强度本地化相关的靶基因的表达,在这些不同的组件或口罩。在传统的AQUA软件,通过一系列的像素的强度阈值的步骤定义的掩模,产生二进制图像,然后通过图像排除的步骤(参见图2)。在下一代软件中,将被隔离的执行在一个完全无监督的方式,使用简单的数学算法。
  水族图像分析。的Aqua分析过程中的示意性表示一个典型的实验中,看着上皮癌中的生物标志物的表达。(1)通过像素强度阈值(二进制门控)和空间图像分析程序生成肿瘤面具。(2a和2b)代细胞质和细胞核特定像素面膜通过二进制浇注。(3)结合细胞质和细胞核特定像素口罩100%相互排斥。(4)确定巧合的目标像素与车厢像素(仅供可视)(点击图片放大)。
  AQUA分析概述在图2中,还提供了一个一步一步的插图AQUA图像分析来完成给定的一个典型的实验,例如使用目标的雌激素受体 ??(ER)与上皮肿瘤。同样,这AQUA分析可以被应用到不同的排列,这取决于应用程序。
  AQUA分析通过像素强度阈值(二进制选通)和空间的图像分析程序(即,填充孔,参见图2a和c)通过产生肿瘤掩模的开始。确定肿瘤掩模像素作为模板,使用相同类型的像素强度阈值是用来识别细胞核和/或细胞质像素(参见图2d和e)。通过100%的互斥的处理,这些图像组合,以提供像素分配条块(参见图2f)。AQUA得分产生,它代表的像素的浓度的目标像素强度/隔室面积的总和。为了可视化的目的,步骤4在图2中示出的目标图像的重叠(颜色为红色)隔室ER的细胞核(在红色与蓝色的核从覆盖的目标像素的品红图象展示共定位;图2小时)。
  标准化由于IHC传统的主观和定性,跨实验室和观察员的标准化是有问题的。由于AQUA技术是客观和严格定量的,也可以是标准化,仪器,实验室,和运营商。HistoRx公司已开发的仪器校准方法,使多个仪器上捕获的信号进行归。11这种标准化是通过光源和内在机校准方法的组合。这些方法是自动化和使用稳定的非生物材料,主校准完成实时数据采集。
  软件算法的方法已经被发展为主要删除操作员决定从图像采集(即,自动曝光)和得分的过程(即,无监督聚类的基于像素的)10在这些方法也可以被应用到任何目标实现的CV还小于5%,这是与其它定量免疫测定法(例如,酶联免疫吸附,流式细胞仪)相媲美。此外,这些标准化方法已应用到众多的标记,包括mTOR的HER2,EGFR,ER和PTEN 10,11。
  开发临床诊断的重要的是能够再现病人分类。例如,目前的ASCO-CAP指南建议,实验室应达到95%的正/负目前HER2检测方法的一致性,12最近的一项研究表明,对于HER2蛋白的得分,介于54%至85%之间的一致性实验室,这些准则低于13正/负一致性检查工具,跨运营商,和染色天AQUA得分。整体一致性从94.5%到99.3%不等。
  这些分析包括所有案件,包括那些将被视为模棱两可的标准IHC方法,并会受到反折到一个不同的方法(即荧光原位杂交)。因此,AQUA分析可以得到一个标准化的蛋白表达得分与一个单一的方法以获得更多的样品,同时仍然允许维持典型的病理实验室的工作流程提供了一个平台。
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