当前位置:主页 > 新闻中心 >
购买时请注意选择相应的产品名称
质谱法荧光胺法两种方法进行准确测定的前提条
      
  质谱法由于PEG的分子量较大,多采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定修饰前后生长激素的质量数,将质量数之差除以PEG的分子量,即可得到每一分子rhGH上,发生修饰的PEG数目。但是,由于MALDI-TOF脉冲式的离子化方式不能精确定量,对于发生多点修饰的rhGH,只能用该方法计算PEG的结合数目,而无法准确计算平均修饰率。因此,该方法只适用于计算单位点修饰药物的平均修饰率。目前我国企业生产的3种PEG-rhGH,均为单位点修饰,利用MALDI-TOF测定的平均修饰率应为10%左右。
  荧光胺法Stocka等人首先采用荧光胺法测定PEG修饰蛋白的平均修饰率[6]。该方法的灵敏度较高,仅需纳克级的蛋白质就能完成。荧光胺本身不发荧光,但可在碱性环境中共价结合到游离氨基上,生成具有高荧光强度的荧光衍生物。没有参与反应的荧光胺则迅速水解为不发荧光的物质。因此,与TNBS法相比,荧光胺法具有更高的灵敏度。与TNBS法相似,荧光胺法同样受反应温度、pH值、时间因素、游离氨基、还原物质的影响,所以应针对不同的PEG化蛋白进行反应条件考察,并建立相应的rhGH工作对照品。同时,由于荧光胺在水溶液中分解极快,为保证操作的便捷与准确性,应将荧光胺的丙酮溶液直接加入到反应液中,并迅速混匀,而不宜在接触到蛋白质溶液之前用水溶液稀释荧光胺。
  TNBS法1966年,Habeeb等人采用三硝基苯磺酸(TNBS)与蛋白表面赖氨酸的ε-氨基和α氨基发生反应,生成在375nm处有特征吸收的三硝基苯酚(TNP)。对于采用游离氨基作为蛋白连接位点的PEG修饰蛋白,PEG修饰将直接减少蛋白表面的自由氨基,因此可以通过将吸光度值与蛋白浓度作图,求得PEG-rhGH与rhGH的斜率,将两者的斜率之差除以rhGH的斜率即可间接计算PEG的修饰程度。但是,该方法的影响因素较多,要求修饰前后的供试品中不得含有游离氨基,不得含有还原型物质,不得含有SDS等表面活性剂,并且极易受到环境温度、pH以及游离PEG的影响。同时,该方法中络合物随着反应时间的延长,吸光度值不断下降,需要考察适宜的反应中止方法以保证测定准确性。而rhGH国家对照品中因为添加了甘氨酸等赋形剂,不能直接用于TNBS法的检测。企业需考察 rhGH与PEG-rhGH在不含上述辅料剂型中的稳定性,并提供rhGH的工作对照品。
  PEG的平均修饰率目前,PEG修饰蛋白的质量标准中平均修饰率的检测方法主要有:三硝基苯磺酸(TNBS)法、荧光胺法、质谱法、液相-示差/蒸发光检测器联用法等。其中,前两种为间接测定法,要求对修饰前后的蛋白质准确定量。该类方法属普通的化学与荧光发光法,操作相对简单;后两种属于直接测定法,虽然结果较为准确,但所用仪器较为特殊或昂贵。因此,建立质量标准时,应考虑采用直接法获得较为可靠的平均修饰率数值,随后建立三硝基苯磺酸(TNBS)法或荧光胺法而纳入标准。同时,如能成功建立直接法中的“液相-示差/蒸发光检测器联用法”,不仅可以准确控制单位点或多位点修饰的PEG-rhGH的平均修饰率,还可以同时进行游离PEG测定,以及PEG的定性鉴别。
  上述两种方法进行准确测定的前提条件是,无论修饰前后,rhGH都必须处于充分舒展的状态,所有的结合位点都能充分暴露。但是,由于PEG枝杈型的空间位阻效应,同时方法易受常规变性剂的干扰,测定结果不可盲目追求理论平均修饰率10%,应根据多批次测定结果,合理制定限度范围。
上一篇:聚乙二醇化重组人生长激素延长作用时间的药物 下一篇:液相-示差/蒸发光检测器联用法



    无法在这个位置找到: xy/left.htm

    

    2013-2019@ 河南寻梦电子商务有限公司版权所有

    豫ICP备17046142号-2