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分子生物学和生物信息学技术的发展
      
  植物种质资源的收集、维护、合理评价及有效利用等问题越来越受到种质资源工作者及相关部门的重视。植物分子生物学尤其是分子标志的发展为植物资源提供了更为清晰的遗传背景,随着对种质资源重要性的认识不时加强。ISSR作为一种新型的分子标志技术,植物种质资源研究尤其是种质资源收集和鉴定、遗传多样性和亲缘关系及基因定位等方面得到较为广泛的应用。然而,ISSR分子标志技术也存在一些不足,例如其大部分为显性标记,不能区分纯合体与杂合体,而且对于显性标记,进行两倍体或多倍体物种的种群多样性研究时,目前还没有一种十分合适的数学模型来进行数据分析。此外,ISSR虽然已经广泛用于植物种资源鉴定研究,但是由于缺乏规范的DNA 指纹图谱库,尚不能大规模广泛应用于作物品种真实性和纯度鉴定。相信随着分子生物学和生物信息学技术的不时发展和改进,ISSR分子标志技术凭借其简便、经济、快速、多态性高、稳定性强等优点将越来越得到广泛使用,特别是应用于大批量样品的研究,为植物种质资源研究发挥更大的作用。
  多集中在对茶花野生资源调查(李宝华,临时以来国内有关茶花品种的研究.2003;李纪元等,2002资源的收集、整理、栽培技术、杂交育种(陈新年,1999组织培养、嫁接繁殖等方面的研究上,对茶花品种间的亲缘关系、品种鉴别一直以来都是依据其花的形态结构和生理性状(陈清炮,1992,而在分子水平上对茶花品种间的亲缘关系、遗传分析与鉴别等方面的研究至今未见报道.
  RA PD扩增结果稳定性和重演性较低,目前在植物亲缘关系和DNA 指纹图谱研究中可以利用的有RA PDAFLPRFLP和ISSR等多种分子标记.但前三种标记均存在一定的局限性.A FLPRFLP技术要求高,利息高,难以在一般的实验室普及与应用.而ISSR分子标志即简单重复间序列(inter-simplesequencerepeat,ISSR,SSwww.gjbzwz.comR标志基础上发展起来的一种新技术,其基本原理是SSR5'或3'端加锚l-4个嘌呤或嘧啶碱基,然后以此为引物,对两侧具有反向排列SSR一段基因组DNA 序列进行扩增.重复序列和锚定碱基是随机选择的,扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后,每个引物可以发生比RA PD方法更多的扩增片段.因此,ISSR不只结合了RA PD通用性,而且具有AFLPRFLP大部分优点,一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的DNA 指纹技术.
  评估不同品种间的异质性,利用ISSR分子标志可以在亲缘关系较近的品种间检测遗传差别.计算亲本之间的遗传距离,从而确定亲本之间的遗传关系和亲缘关系,并进而划分杂交优势群,提高杂种优势潜力;同时ISSR分子标志可以用来建立DNA 指纹图谱,因在同一物种的各个品种间存在大量的多态性标记,某一品种具有区别于其它品种的独特标志即一些特异性DNA 片段的组合就称为该品种的"指纹",各品种的独特的指纹片段构成该物种的DNA 指纹图谱,具有类似于人的指纹那般的高度个体特异性和稳定性.DNA 指纹图谱在植物育种中有广泛应用,因为(1每个品种DNA 指纹差异可直接提供与目标性状有关的DNA 水平的信息,防止了环境的干扰,从而能大大提高杂交育种中对亲本及后代理想单株的选择效率,2通过检测品种是否只具有该品种特有的标志指纹片段,可以很有效地鉴定品种纯度与真伪,以及用于新品种登记和品种知识产权维护等
  其基本原理就是SSR3′或5′端锚定l4个碱基作引物,ISSR由加拿大蒙特利尔大学zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标志技术。对两侧具有反向排列SSR一段序列进行扩增,而不是扩增SSR自身。ISSR分子标志技术兼具SSRRA PDRFLPAFLP等分子标记的优点,与SSR相比,ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低,且多态性更丰富;与RA PD相比,ISSR重复性高,稳定性好,同时具备RA PD简便、易操作等特点;与RFLPAFLP相比,ISSR更快捷、利息较低、DNA 用量小、平安性较高。由于上述优点,ISSR标志技术在植物分子生物学研究中得到广泛的应用。本文将主要从植物种质资源收集和鉴定、遗传多样性和亲缘关系、优异基因的发掘和定位等方面阐述ISSR分子标志在植物种质资源研究中的应用。
  目前已成为种质资源收集和种质鉴定中一个非常重要的技术手段,20世纪90年代后期发展起来的DNA 指纹图谱(DNA fingerprint技术具有多态性丰富、分辨率高、稳定性强等优点。可以用来对种质资源进行评估和品种真实性和纯度鉴定。随着种子产业市场化发展,准确、快速、简捷的种子质量检测技术和方法研究成为研究的热点,ISSR分子标志技术以其稳定可靠、重复性好、多态性丰富等优点在种质资源收集和品种鉴定中越来越受到重视。利用ISSR分子标志绘制植物种质资源的DNA 指纹图谱,作为其特征性状建立种质资源数据库,可用于种质鉴别。
  并进行图谱分析和品种鉴定。Moreno等成功地用6个ISSR引物鉴定了11个通过形态和RA PD技术难以区分的葡萄(VitiviniferaL.品种。Chater等利用ISSR分子标志技术构建油菜DNA 指纹图谱。
  仅用6条引物就能将62个样品中的56个区分开,Charter和WilKinson运用ISSR技术辅助可可(Theobromacacao种质资源的收集。证明快速、简单和重复性强的ISSR技术在可可种质资源收集和评估方面存在巨大的潜力。Kumar等运用ISSR分子标志技术鉴定4个因争议引发官司的辣椒(Capsicumwww.gjbzwz.comnnum品种,被认为是对运用可靠的DNA 分子标志方法来维护植物育种者权利的首次有益尝试。Carvalho等成功构建了5个杂交小麦F1与其亲本的DNA 指纹图谱,用以检测F1真实性和纯度。Isshiki等用34个ISSR引物对8个茄子品种和12个相关自交系进行分析,共扩增出552个位点,多态性位点达到99.1%聚类分析将20个材料分为7类,研究结果标明,ISSR分子标志技术可用于茄子系统发育评估和品种鉴定。Liu等采用RA PDISSRSRA P三种分子标志构建了35个特异晚抽薹萝卜品种的DNA 指纹图谱,并对35个品种进行聚类分析和比较。
  AGnACnTGn等二核苷酸重复引物在小麦中多态性较高,王新宇等用ISSR分子标志技术对多态性水平较低的小麦种内指纹图谱的初步研究发现。能将亲缘关系很近的品种或品系区分开,研究结果标明,与RA PDRFLP等分子标记相比,ISSR标志具有简便、快捷、利息低、多态性水平高等特点,一种值得进一步研究的分子标志技术。潘清平等对玉竹主要栽培品种、野生种及易混淆品黄精进行ISSR扩增,研究发现ISSR分子标志可用于玉竹的品种鉴定和良种选育研究。黄光文等用4条ISSR引物成功构建18个水稻新材料的DNA 指纹图谱。沈永宝等用5条ISSR引物胜利构建银杏13个主栽品种的ISSR指纹图谱用以品种鉴别。景建洲等用1条ISSR引物就可以将10个玉米品种区别开来。缪恒彬等选用21个ISSR引物对新选育的25个小菊品种进行扩增并建立了其1SSR指纹图谱,其中一条引物ISSR35可将25个品种完全区分开。何霭如等以华南地区生产上大面积应用的7个杂交水稻组合及其父母本为材料,研究利用ISSR标志鉴定杂交稻种子纯度的可行性,研究结果标明,ISSR标志可用于杂交稻种子的纯度鉴定。陈健文等用30个ISSR引物对来自10个杂交组合的164个甘蔗无性系的杂种进行真实性鉴定,结果标明,有160个是真正的杂种,大部分组合仅用2个ISSR引物即可鉴定杂种的真实性,少数组合甚至用1个标记就行,说明利用ISSR标志进行甘蔗杂种真实性的鉴定可行且相当有效。
  人类赖以生存和发展的重要物质基础,植物种质资源是生物遗传多样性的重要组成局部。也是农业起源和发展的基本前提。植物种质资源及其多样性为改良栽培品种、选育新品种及开展遗传生物学研究,提供丰富的遗传变异和基因资源。遗传多样性和亲缘关系分析是植物种质资源研究和评价的主要内容之一。ISSR分子标志技术凭借其多态性丰富等特点已经被广泛应用于植物种质资源遗传多样性和亲缘关系研究。
  研究结果清楚地支持物种P.cievelandii二倍体杂种起源的说法。Joshi等用ISSR技术研究稻属(OryzaL.42个品种,Wofe等用8个引物对玄参科钓钟柳属(PenstemonL.杂种进行ISSR分析。包括28个野生品种(9个基因型)1个栽培种以及3个相关属的品种,发现在种间和种内均表示出很高的多态性,研究结果标明,稻属是多途径进化的Behera等用29个RA PD和15个ISSR引物分析38份印度苦瓜(Momordicacharantiavar.charantiaandvar.muricata进行遗传多样性分析,29个RA PD引物共扩增出208条带,多态性条带76.36.5%条,15个ISSR共扩增出125个位点,多态性位点9474.7%个。聚类分析结果标明,基于RA PD和ISSR多态性评估是一致的苦瓜栽培品种和野生材料的起源不同,此研究为苦瓜种内遗传分析和育种选择提供了依据。chen等用ISSR分子标志对我国92个藕莲(NelumbonucifraGaertn.品种进行遗传多样性分析,结果92个品种被划为两类,一是大部分资料起源于我国的地方品种,另一类是引种于美国的品种。Fang等利用22条ISSR引物研究高粱、杂交高粱、甜高梁、苏丹草、黑高粱和假高粱6种高梁属植物的遗传关系,结果标明,这6种高粱属植物在DNA 水平上具有较高的遗传多样性,聚类分析将6种高粱分为两大组,相互间的遗传距离为0.25为研究高粱属植物的分类、鉴定和进化提供了分子生物学方面的理论依据。Verma等对9个香草种群遗传多样性进行RA PD和ISSR分析,并对两种分子标记的聚类结果进行了比拟。Wang等用14条ISSR引物对我国珍稀濒危绞股蓝(CynostemmapentaphyllumThunb.Makino14个居群的140个样本进行分析,研究发现居群间遗传变异丰富而居群内多样性较低,并根据分析结果提出对绞股蓝种质资源保管的战略。Thimmappaiah等用RA PD和ISSR研究100个腰果种质资料的遗传多样性和亲缘关系,聚类分析结果将其分成13个组,所有资料中,NRC-142与NRC-12亲缘关系最远,NRC-231与NRC-232最近。
  研究结果标明,郭春芳等用ISSR和PA P两种分子标志技术对茶树种质资源的遗传多样性进行分析。ISSR分子标志具有更大的标志效率和多样性检测能力。杨本超等利用ISSR标志分析了24份代表性烤烟种质的遗传多样性,品种间遗传相似指数范围为0.660.85标明其遗传多样性较低,需要拓宽烤烟种质的遗传基础,此外,利用2个多态性好的ISSR引物可以将这24份烤烟资料区分开,每个品种都有各自独特的指纹图谱,标明ISSR标志适于烟草品种鉴定和遗传多样性研究。姚明哲等利用ISSR引物分析我国36个茶树无性系品种的遗传多样性和亲缘关系,20个ISSR引物共扩增出368条谱带,其中多态性谱带占99.7%研究结果标明,茶区内茶树品种的遗传多样性低于总体水平,江南和华南茶区主栽无性系品种的多样性高于西南茶区,而区域因素引起的变异(5.6%远小于品种因素(94.4%亲缘关系树状图在分子水平上显示了国主要茶树无性系品种间的亲缘关系,为今后茶树育种亲本的选配提供了理论依据。毛伟海等对我国南方57个长茄种质资源资料进行ISSR分析,结果显示品种间的相似系数在0.5l0.98之间,标明茄子栽培种内品种间的遗传基础相对较狭窄,聚类结果将57个品种分为6个类群,类群的划分与地方来源没有很大的关系。魏臻武等用SSR和ISSR引物对55个国内外苜蓿品种(品系)遗传多样性进行研究,将55个苜蓿种质划分为5个大类群和7个类型,结果标明,国苜蓿地方品种遗传基础广阔,基因型表示特异性的同时又有较强的地域性,且苜蓿品种间的遗传距离大,表示出遗传基础的异质性,为苜蓿引种、亲本选配和种质资源评价提供了依据。马艳明等选用11个ISSR引物对黄淮麦区96个小麦推广品种(系)进行遗传多样性分析,品种间的相似系数变化范围为0.530.9l平均为0.6096份资料被聚成8个大类群,共14个亚类,品种间存在着不同的遗传多样性差别,类群与系谱和原产地无关。姜伟等对48份棉花种质资源的遗传多样性进行分析,1l条ISSR引物共扩增出92个条带,多态性条带77个(83.70%聚类结果将48个种质资源划分为4个大类,湛江野生棉、廉江野生棉与其他品种在遗传上有很大区别,属于较原始类型,归为一类;长绒棉与陆地棉品种存在明显的遗传差异也单独归为一类;其他不同省份的陆地棉品种在遗传上有较高的相似性,归为其他类型。李强等用ISSR分子标志分析了中国62份甘薯主要亲本的遗传多样性,其遗传距离为0.1580.924聚类结果将其分为2类,一类为国内自育亲本,另一类为外引亲本,发现亚洲亲本遗传多样性高于非洲和美洲亲本,并且与其他亲本间遗传距离较远。唐丽首次建立了优化的适于南天竹种质资源遗传多样性研究的ISSR-PCR反应体系,并对湖南省13个不同地区的种群遗传多样性进行分析,聚类分析将邵东县、祁阳县、韶山市与宜章县的种源聚为一类,芦淞区与新化县的种源聚为一类,柏加镇、岳阳县与黄花镇的种源聚为一类,洪江县、桃江县、张家界与衡山县的种源同其它三类的亲源关系较远,且相互单独为一类。宋振巧等以山东泰安、临沂、莱芜、菏泽和潍坊5个居群的72份丹参株系为材料,利用ISSR分子标志进行群体遗传结构的研究,聚类结果标明莱芜居群和临沂居群遗传一致度最大,泰安居群与其他4个居群遗传关系最远;分析发现菏泽居群和泰安居群是相对独立的群体,但5个居群间存在局部基因交流,研究还表明,泰安居群遗传多样性最丰富,建议在制定原位种质维护计划时应优先考虑泰山周边地区的丹参。
  进而获得目的基因,充分发掘和利用植物种质资源这一天然的优异基因库是育种工作者一直以来努力的方向。利用分子标志对某一特定DNA 区域内的目的基因进行定位。用于种间或种内转移,也是分子标志应用于育种,发明新材料的重要手段。
  ISSR标志UBC857980与马铃薯抗病毒基因(potatoviruYRy-fsto连锁,Fli等研究发现。并将其标记在土豆Ⅻ染色体的RFLP连锁图上。Vaillancourt等利用ISSR分子标志对不同来源的小麦、黑麦及其杂交的黑小麦进行扩增,识别出3个小麦诊断序列,1个专门用于黑小麦诊断的ISSR引物被标记,研究认为ISSR引物可协助小麦育种家扫描可能存在黑麦染色体的基因型。Redi等用17个ISSR分子标志对12个水稻品种(3个耐旱、3个耐涝、3个耐盐和3个普通对照)进行分析,研究结果标明,基于(GA 重复序列的ISSR引物可用于水稻耐旱、耐涝、耐盐基因及相关等位基因的鉴定和定位。Liu等利用RA PD和ISSR分子标志对K型小麦(TriticumaestivumL.不育恢复系LK783主效恢复基因进行标志定位,得到RA PD引物OPKl8和ISSR引物UBC845可应用于对育性恢复基因的标志辅助选择。Sharma等研究发现ISSR分子标志可用于苗期加州希蒙得木(Simmondsiachinensia雌雄株的选择。
  并以147株个体组成的F2分离群体作为恢复基因的标志群体,关荣霞等以小麦T型恢复系2114和不育系ND44A 配制杂交组合。分别用43个ISSR引物和181对SSR引物对两个亲本进行了扩增,经连锁分析,证明2个标记(UBC808和UBC848与小麦T型细胞质雄性不育恢复基因Rf6连锁,遗传距离分别为7.9cM和4.9cM但没找到与Rf6连锁的SSR标志。此外,对ISSRSSR等方法在小麦中的多态性比例进行了比拟,发现ISSR具有更高的多态性,特别是外源基因的检测中能提供更丰富的遗传信息。陈学好等以黄瓜单性结实品系EP-6和非单性结实品系ZR-2为亲本构建群体,采用分离群体分组分析(bulksegreganalysiBSA 筛选与黄瓜单性结实基因连锁的分子标志。筛选到引物N92亲本和DNA 池之间扩增出一条大小为850bp多态性片段,经F2代群体135个单株验证,该片段稳定出现,单性结实植株中表示为无带,非单性结实植株中表示为有带,可以作为鉴别单性结实与非单性结实的标志引物。遗传连锁分析标明,该标志与单性结实基因连锁距离为18.9cM为黄瓜单性结实基因的分子标志筛选和分子标志辅助育种奠定了初步基础。
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